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大腸菌群計數檢驗步驟

第一法大腸菌群MPN 計數
操作步驟
6.1、樣品的稀釋
6.1.1、 固體和半固體樣品:稱取25g 樣品,放人盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內,8 00or/min-10 000r/min 均質1 min-2 min ,或放人盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的
無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1 min-2 min ,制成1:10 的樣品勻液。
6.1.2、 液體樣品:以無菌吸管吸取25ml樣品,置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的
無菌玻璃珠)中,充分棍勻,制成1:10 的樣品勻液。
6.1.3、 樣品勻液的pH 值應在6.5-7.5 之間,必要時分別用1mol/L 氫氧化鈉(NaOH )或1 mol/L 鹽酸(HCI )調節。
6.1.4、 用1ml無菌吸管或
微量移液器吸取1:10 樣品勻液1ml,沿管壁緩緩注人9ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1 支1ml無菌吸管反復吹打,使其混合均勻,制成1:100 的樣品勻液。
6.1.5、 根據對樣品污染狀況的估計,按上述操作,依次制成10 倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次,換用1 支1ml無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過程不得超過15 min 。
6.2、 初發酵試驗
每個樣品,選擇3 個適宜的連續稀釋度的樣品勻液(
液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種3 管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯,每管接種1ml(如接種量超過1ml,則用雙料LST肉湯), 36℃±1℃ 培養24h±Zh ,觀察倒管內是否有氣泡產生,如未產氣則繼續培養至48h±2h 。記錄在24h 和48h 內產氣的LST 肉湯管數。未產氣者為大腸菌群陰性,產氣者則進行復發酵試驗。
6.3、 復發酵試驗
用接種環從所有48h±2h 內發酵產氣的LST 肉湯管中分別取培養物l環,移種于煌綠乳糖膽鹽( BGLB)肉湯管中,36℃±1℃ 培養48h±2h ,觀察產氣情況。產氣者,計為大腸菌群陽性管。
6.4、
大腸菌群最可能數(MPN )的報告
根據
大腸菌群陽性管數,檢索MPN 表(見附錄B ) ,報告每克(或毫升)樣品中大腸菌群的MPN 值。

第二法
大腸菌群平板計數
8、 操作步驟
8.1、 樣品的稀釋
按6.1 進行。
8.2、 平板計數
8.2.1、 選取2 個~3 個適宜的連續稀釋度,每個稀釋度接種兩個無菌平皿,每皿1ml。同時分別取1ml生理鹽水加人兩個無菌平皿作空白對照。
8.2.2、 及時將15 mL-20ml冷至46℃ 的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA )約傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿,將培養基與樣液充分混勻,待瓊脂凝固后,再加3 mL-4mlVRBA 覆蓋平板表層。翻轉平板,置于36℃±l℃ 培養18h-24h 。
8.3、
平板菌落數的選擇
選取菌落數在30-150 之間的平板,分別計數平板上出現的典型和可疑
大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環,菌落直徑為0.5 mm 或更大。
8.4、 證實試驗
從VRBA 平板上挑取10 個不同類型的典型和可疑菌落,分別移種于BGLB 肉湯管內,36℃±1℃ 培養24h-48h ,觀察產氣情況。凡BGLB 肉湯管產氣,即可報告為大腸菌群陽性。
8.5 、大腸菌群平板計數的報告
經最后證實為
大腸菌群陽性的試管比例乘以8.3 中計數的平板菌落數,再乘以稀釋倍數,即為每克(或毫升)樣品中大腸菌群數。

第三法
大腸菌群PetrifilmTM 測試片法
10、 操作步驟 10.1 樣品的稀釋
按6.1 進行。
10.2、 測定
10.2.1、 樣品接種及培養
將待檢樣品選取2 個-3 個適宜的連續稀釋度,每個稀釋度接種兩張測試片。將PetrifilmTM
大腸菌群測試片置于平坦實驗臺面,揭開上層膜,用吸管吸取1ml樣液垂直滴加在測試片的中央,將上層膜緩慢蓋下,避免氣泡產生和上層膜直接落下。把壓板(平面底朝下)放置在上層膜中央,輕輕地壓下,使樣液均勻覆蓋于圓形的培養面積上,切勿扭轉壓板。拿起壓板,靜置至少1 min 以使培養基凝固。將測試片的透明面朝上置于培養箱內,堆疊片數不超過20片,36℃±1℃ 培養24h±2h 。
10.2.2、 判讀
培養24h±Zh 后應立即計數,可目測或用
標準菌落計數器、放大鏡或PetrifilmTM 自動判讀儀來計數。紅色有氣泡的菌落確認為大腸菌群。圓形培養區邊緣上及邊緣以外的菌落不作計數。當培養區域出現大量氣泡,大量不明顯小菌落或培養區呈暗紅色三種情況,表明大腸菌群的濃度較高,需要進一步稀釋樣品以獲得更準確的讀數。
10.3、
大腸菌群測試片計數的報告
選取菌落數在15-150 之間的測試片,計數其紅色有氣泡的菌落數,兩個測試片的平均
菌落數乘以稀釋倍數即為每克(或毫升)樣品中的大腸菌群菌落形成單位(CFU )數。如果所有稀釋度測試片上的菌落數都小于15 ,則計數稀釋度最低的測試片上的平均菌落數乘以稀釋倍數報告;如果所有稀釋度的測試片上均無菌落生長,則以小于1 乘以最低稀釋倍數報告;如果最高稀釋度的菌落數大于150 ,計數最高稀釋度的測試片上的平均菌落數乘以稀釋倍數報告。計數菌落數大于150 的測試片時,可計數一個或兩個具有代表性的方格內的菌落數,換算成單個方格內的菌落數后乘以20 即為測試片上估算的菌落數(圓形生長面積為20cm2 , )。報告單位以CFU/g (或CFU/mL )表示。

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